快速內(nèi)切酶 AflII

同裂酶：BspTI, BfrI, BstAFI, MspCI, Vha464I

（注：同裂酶對(duì)于不同的甲基化修飾可能具有不同敏感性。）

產(chǎn)品組成

快速內(nèi)切酶 AflII產(chǎn)品簡(jiǎn)介

LabFD™ 快速內(nèi)切酶是一系列經(jīng)過(guò)基因工程重組的快速限制性?xún)?nèi)切酶，適用于質(zhì)粒 DNA、PCR 產(chǎn)物或基因組 DNA 等的快速酶切。

所有 LabFD™ 快速內(nèi)切酶在通用的LabFD™或LabFD™ Color Buffer中都具有優(yōu)良的活性，能夠在 5~15 分鐘內(nèi)完成酶切。此外，蘭博利德去磷酸化、連接試劑在LabFD™ Buffer 中均具有 100% 活性，支持一管化反應(yīng)，提升“酶切-修飾-連接"的體驗(yàn)。LabFD™ Color Buffer 包括紅色和黃色示蹤染料，可將產(chǎn)物直接用于凝膠電泳。LabFD™ Color Buffer 的紅色染料與 2500 bp 雙鏈DNA 片段在 1% 瓊脂糖凝膠中遷移速率接近；黃色染料與 10 bp雙鏈 DNA 片段在 1% 瓊脂糖凝膠中遷移速率接近。

建議反應(yīng)條件：1×LabFD™緩沖液；37℃溫育；參照“DNA 快速酶切流程"配制反應(yīng)體系。

失活條件：80℃溫育 20 min。

質(zhì)量控制

功能活性檢測(cè)

37℃下，在 20ul 反應(yīng)體系中，1ul LabFD™ AflII 能夠在 15min 內(nèi)完quan消化 1ug pEPE DNA。

超長(zhǎng)時(shí)間溫育檢測(cè)

37℃下，將 1ul LabFD™ AflII 與 1ug pEPE DNA共同溫育 3h，未檢測(cè)到其他核酸酶污染或星號(hào)活性引起的底物非特異性降解，延時(shí)酶切可能出現(xiàn)星號(hào)活性。

酶切-連接-再酶切檢測(cè)

37℃下，使用 10 倍酶量的 LabFD™ AflII 消化 DNA 底物，回收酶切產(chǎn)物，在 22℃下使用 T4 DNA Ligase (Fast) 可以將超過(guò)90% 的酶切產(chǎn)物重新連接。將連接產(chǎn)物再次回收后，使用相同的內(nèi)切酶可以重新切開(kāi) 95% 以上的連接產(chǎn)物。 

使用方法

1.DNA 快速酶切流程

（1）在冰上按如下建議的加樣順序配制反應(yīng)體系：

a. 本體系適用于經(jīng)過(guò)純化的 PCR 產(chǎn)物酶切。未純化的 PCR 產(chǎn)物具備一定的離子強(qiáng)度，10× LabFD™ Buffer 加入量可適當(dāng)減少至2μl。但由于DNA 聚合酶同時(shí)具有外切酶活性，會(huì)影響酶切產(chǎn)物，因此如下一步需進(jìn)行克隆等操作，建議酶切前對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。

（2）輕柔吸打或輕彈管壁以混勻（切勿渦旋），然后瞬時(shí)離心以收集掛壁液滴；

（3）37℃溫育 15min（質(zhì)粒），或 15~30min（PCR 產(chǎn)物），或 30~60min（基因組 DNA）；

（4）80℃溫育 20min 即可使酶失活，停止反應(yīng)（可選）。

（5）如果使用 LabFD™ Color Buffer 進(jìn)行酶切反應(yīng)，得到的產(chǎn)物可以直接進(jìn)行上樣電泳。

2.雙酶切或多酶切

（1）每種快速內(nèi)切酶的用量為1ul，并根據(jù)需要適當(dāng)擴(kuò)大反應(yīng)體系；

（2）所有快速內(nèi)切酶的體積總和不得超過(guò)總反應(yīng)體系的 1/10；

（3）如果所用的幾種快速內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同，應(yīng)先以最適溫度低的酶開(kāi)始酶切，再添加最適溫度較高的酶，在其最適反應(yīng)溫度下進(jìn)行酶切反應(yīng)。

3.適用于質(zhì)粒的擴(kuò)大反應(yīng)體系

注：如果總反應(yīng)體系大于 20ul，應(yīng)適當(dāng)增加溫育時(shí)間，盡量使用水浴、金屬浴或沙浴。

不同 DNA 中的酶切位點(diǎn)數(shù)量

甲基化修飾影響

在不同反應(yīng)緩沖液中的活性

注：活性數(shù)據(jù)來(lái)自 LABLEAD 限制酶標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系下的檢測(cè)。