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產(chǎn)品中心分子生物學(xué)試劑PCR相關(guān)T02142xTaq ultra PCR Mix 藍色（含染料）
產(chǎn)品簡介
product
產(chǎn)品分類| 品牌 | LABLEAD | 貨號 | T0214 |
|---|---|---|---|
| 供貨周期 | 一周 |
2xTaq ultra PCR Mix 藍色（含染料）
產(chǎn)品貨號：T0214
存儲條件：-20℃
2xTaq ultra PCR Mix 藍色（含染料）
產(chǎn)品說明
2x Taq Ultra PCR mix 的濃度為 2x，使用方便快捷，能減少 PCR操作過程中的污染，使用時只需取適量2x Taq Ultra PCR mix(藍色染料)，加入模板和引物，并加入ddH2O 補足體積，使反應(yīng)體系濃度為 1x，即可進行 PCR 反應(yīng)。PCR 產(chǎn)物 3'端帶突出A堿基，純化后可直接用于 T/A 克隆。
本產(chǎn)品中含有 Taq DNA 聚合酶和一種含有 3'→5'外切活性的蛋白，能夠高效擴增≤7 kb 的 DNA 片段，擴增產(chǎn)量高，配合優(yōu)化后的反應(yīng)緩沖液，可實現(xiàn)對不同 GC 含量(30%~70%)的高效擴增。此外相較于普通Taq PCR Mix 延伸速度提高了 2~4 倍，可有效縮短反應(yīng)時間。
本PCR Mix中包含兩種染料，PCR產(chǎn)物無需添加 Loading Buffer可直接點樣電泳，且電泳過程中會出現(xiàn)藍色和紅色兩個指示條帶。該染料不影響 PCR 擴增效率，但對于需要對PCR 產(chǎn)物進行吸光度、熒光等光學(xué)分析的實驗，建議在分析前對 PCR產(chǎn)物進行純化。
質(zhì)量控制
核酸內(nèi)切酶活性檢測
將25 μl 2x Taq ultra PCR Mix與 200 ng 超螺旋質(zhì)粒 DNA 配制成 50 μl 反應(yīng)體系，在37°C下，共同溫育4h后，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，少于 10% 的質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)變成缺刻或線性狀態(tài)。
非特異性核酸酶活性檢測
將25 μl 2x Taq Ultra PCR Mix與 15 ng 雙鏈 DNA 片段配制成 50 μl反應(yīng)體系，在 37℃下溫育 16 h，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測雙鏈 DNA 底物無變化。
使用方法
1.常規(guī) PCR 反應(yīng)體系 ( 冰上操作 )
試劑 | 使用量 | 終濃度 |
2x Taq Ultra PCR mix | 25 ul | 1x |
正向引物(10uM)b | 1~2 ul | 0.2~0.4uM |
反向引物(10uM)b | 1~2 ul | 0.2~0.4uM |
模板DNAc | X ul | |
ddH2O | Up to 50 ul |
a. 需融解完quan后使用，防止離子濃度不均勻；
b. 引物推薦終濃度為0.2~0.4 μM，效果不佳時可以在 0.1~1 μM 濃度范圍內(nèi)進行調(diào)整；
c. 不同模板最佳反應(yīng)濃度有所不同，以 50 μl 體系為例：模板為基因組 DNA 時一般推薦的使用量為 10~200 ng；當(dāng)模板為質(zhì)?；虿《?DNA 時，一般推薦的使用量為 10 pg~5 ng。模板量過多時容易造成非特異性擴增。
2. 三步法 PCR 反應(yīng)程序
步驟 | 溫度 | 時間 | 循環(huán) |
預(yù)變性d | 95℃ | 3~5 min | |
變性 | 95℃ | 30 s | 30-35cycles |
退火e | 55~65℃ | 30 s | |
延伸 | 72℃ | 15~30 s/kb | |
終延伸 | 72℃ | 5 min |
3. 二步法 PCR 反應(yīng)程序
步驟 | 溫度 | 時間 | 循環(huán) |
預(yù)變性d | 95℃ | 3~5 min | |
變性 | 95℃ | 30 s | 30-35cycles |
退火和延伸e | 60~65℃ | 30 s/kb | |
終延伸 | 72℃ | 5 min |
d. 菌落 PCR 時預(yù)變性 10 min，可充分破壁細胞，大腸桿菌或酵母菌均可高效擴增。
e. 退火溫度請根據(jù)引物 Tm 值設(shè)置。如果需要，推薦通過建立溫度梯度尋找引物與模板結(jié)合的最適溫度。此外，退火溫度直接決定擴增特異性，如發(fā)現(xiàn)擴增特異性差，可適當(dāng)提高退火溫度。
f. 目的片段長度< 3 kb，延伸時間可縮短至 15 s/kb；目的片段長度>3 kb，延伸時間建議 30 s/kb。若要達到最佳擴增效果或較高產(chǎn)量，推薦統(tǒng)一使用 30s/kb 速度延伸。
注意事項
一、引物設(shè)計
1. 引物 3' 端最后一個堿基最好為 G 或者 C。
2. 引物 3' 端最后8個堿基應(yīng)避免出現(xiàn)連續(xù)錯配，同時也避免出現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
3. 正向引物和反向引物的 Tm 值相差不超過 1℃為佳，Tm值調(diào)整至 55~65°C為佳(引物Tm值推薦使用 Primer Premier5進行計算)。
4. 引物額外附加序列，即與模板非配對序列，不應(yīng)參與引物 Tm 值計算；引物的 GC 含量控制在 40%~60% 之間。
5. 引物 A、G、C、T整體分布要盡量均勻，避免使用 GC 或者 AT 含量高的區(qū)域。
6. 引物內(nèi)部或者兩條引物之間避免有5個堿基以上的互補序列，兩條引物的 3'端避免有3個堿基以上的互補序列。
7. 引物設(shè)計完畢請使用 NCBI BLAST 功能檢索引物特異性，以避免產(chǎn)生非特異性擴增。
二. 產(chǎn)物電泳與染色
建議使用泡染法進行電泳后染色，膠染法會導(dǎo)致紅色指示條帶發(fā)生彌散，不利于條帶指示，對藍色指示條帶無影響。藍色條帶在 1% TAE 緩沖液中遷移速率約等于 1500 bp，紅色條帶在 1% TAE 緩沖液中遷移速率約等于 100 bp。
010-60608020
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