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產(chǎn)品中心分子生物學(xué)試劑內(nèi)切酶F5536S-600 rxns快速內(nèi)切酶 EcoRI
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
product
產(chǎn)品分類| 品牌 | 其他品牌 | 供貨周期 | 現(xiàn)貨 |
|---|---|---|---|
| 應(yīng)用領(lǐng)域 | 食品/農(nóng)產(chǎn)品,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁,制藥/生物制藥 |
EcoRI 快速內(nèi)切酶
產(chǎn)品貨號(hào)：F5536S
儲(chǔ)存條件：-20℃
同裂酶：FunII
注：同裂酶對(duì)于不同的甲基化修飾可能具有不同敏感性。
產(chǎn)品組成
組分 | 規(guī)格 |
LabFD™ EcoRI | 600ul |
10×LabFD™ Buffer | 3×1ml |
10×LabFD™ Color Buffer | 3×1ml |
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
LabFD™快速內(nèi)切酶是一系列經(jīng)過基因工程重組、能夠在5~15 分鐘內(nèi)精確完成 DNA 切割的限制性內(nèi)切酶，適用于質(zhì)粒 DNA、PCR 產(chǎn)物或基因組 DNA 等的快速酶切。LabFD™ 快速內(nèi)切酶具有如下特點(diǎn)：5~15 分鐘內(nèi)即可完成酶切；共用一種酶切Buffer，大大簡(jiǎn)化酶切反應(yīng)體系；良好的酶活冗余度，輕松應(yīng)對(duì)底物過量或困難模板酶切。此外，LABLEAD生命去磷酸化、連接試劑在LabFD™酶切Buffer 中具有 100% 活性，支持一管化反應(yīng)，提升“酶切-修飾-連接"的體驗(yàn)。
建議的反應(yīng)條件：
1× LabFD™緩沖液；
37℃溫育；
參照“DNA快速酶切流程"配制反應(yīng)體系
失活條件
80℃溫育20min。
質(zhì)量控制
功能活性檢測(cè)
最適反應(yīng)溫度下，在20ul反應(yīng)體系中，1ul LabFD™EcoRI能夠在15min 內(nèi)wanquan消化1ug λDNA。
超長(zhǎng)時(shí)間溫育檢測(cè)
最適反應(yīng)溫度下，將 1ul LabFD™ EcoRI 與 1ugλDNA共同溫育3h，未檢測(cè)到其他核酸酶污染或星號(hào)活性引起的底物非特異性降解，延時(shí)酶切可能出現(xiàn)星號(hào)活性。
酶切-連接-再酶切檢測(cè)
最適反應(yīng)溫度下，使用 1ul LabFD™ EcoRI消化底物，回收酶切產(chǎn)物。在22℃下使用適量Fast T4 DNALigase可以將酶切產(chǎn)物重新連接。將連接產(chǎn)物再次回收后，使用相同的內(nèi)切酶可以重新切開連接產(chǎn)物。
非特異性內(nèi)切酶活性檢測(cè)
最適反應(yīng)溫度下，將1ul LabFD™ EcoRI與1ug超螺旋質(zhì)粒DNA共同溫育4h，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，質(zhì)粒DNA仍然處于超螺旋狀態(tài)。
藍(lán)白斑檢測(cè)
將含有單lacZα基因的載體以1ul LabFD™ EcoRI消化，重新連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含有對(duì)應(yīng)抗生素、IPTG 和X-gal的LB培養(yǎng)基平板上。連接正確的產(chǎn)物會(huì)生長(zhǎng)出藍(lán)色菌落，而連接錯(cuò)誤（即DNA末端切口不完整）的產(chǎn)物將得到白色菌落。對(duì)于LabFD™系列限制酶而言，白色菌落比例應(yīng)小于1%。
使用方法
1.DNA快速酶切流程
1）在冰上按如下建議的加樣順序配制反應(yīng)體系：
質(zhì)粒 DNA | PCR 產(chǎn)物 | 基因組 DNA | |
ddH2O | 15ul | 16ul | 30ul |
10×LabFD™ Buffer或10×LabFD™ Color Buffer | 2ul | 3uL注 | 5ul |
底物DNA | 2ul(up to 1ug) | 10ul (~0.2ug) | 10ul (5ug) |
LabFD™ EcoRI | 1ul | 1ul | 5ul |
Total | 20ul | 30ul | 50ul |
注：本體系適用于經(jīng)過純化的PCR產(chǎn)物酶切，未純化的PCR具備一定的離子強(qiáng)度，10xLabFDTMbuffer加入量可適當(dāng)減少至2ul。但由于DNA聚合酶同時(shí)具有外切酶活性，會(huì)影響酶切產(chǎn)物，因此如下一步需進(jìn)行克隆等操作，建議酶切前對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。
2）輕柔吸打或輕彈管壁以混勻（切勿渦旋），然后瞬時(shí)離心以收集掛壁液滴；
3）37℃溫育15 min（質(zhì)粒），或15~30 min（PCR 產(chǎn)物），或30~60min（基因組DNA）；
4）80℃溫育20 min即可使酶失活，停止反應(yīng)。
2.雙酶切或多酶切
1）每種快速內(nèi)切酶的用量為1ul，并根據(jù)需要適當(dāng)擴(kuò)大反應(yīng)體系；
2）所有快速內(nèi)切酶的體積總和不得超過總反應(yīng)體系的1/10；
3）如果所用的幾種快速內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同，應(yīng)先以最適溫度低的酶開始酶切，再添加最適溫度較高的酶，在其最適反應(yīng)溫度下進(jìn)行酶切反應(yīng)。
3.適用于質(zhì)粒的擴(kuò)大反應(yīng)體系
DNA | 1ug | 2ug | 3ug | 4ug | 5ug |
LabFD™ EcoRI | 1ul | 2ul | 3ul | 4ul | 5ul |
10×LabFD™ Buffer或10×LabFD™ Color Buffer | 2ul | 2ul | 3ul | 4ul | 5ul |
Total | 20ul | 20ul | 30ul | 40ul | 50ul |
注：如果總反應(yīng)體系大于20ul，應(yīng)適當(dāng)增加溫育時(shí)間，盡量使用水浴、金屬浴或沙浴。
不同 DNA 中的酶切位點(diǎn)數(shù)量
λDNA | ΦX174 | pBR322 | pUC57 | pUC18/19 | SV40 | M13mp18/19 | Adeno2 |
5 | 0 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 5 |
甲基化修飾影響
Dam | Dcm | CpG | EcoKI | EcoBI |
無影響 | 無影響 | 序列可能重疊 剪切受阻 | 無影響 | 無影響 |
在不同反應(yīng)緩沖液中的活性
LabFD™ Buffer | Thermo Scienti?c FastDigest Buffer | NEB CutSmart® Buffer | Takara QuickCut™ Buffer | |
活性 | 100% | 100% | 100% | 100% |
注：活性數(shù)據(jù)來自LABLEAD限制酶標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系下的檢測(cè)
010-60608020
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