Flag-Nanoab-Agarose

產(chǎn)品貨號：FNA-25-500

儲存條件：4℃一年；-80℃長期保存，避免反復(fù)凍融

產(chǎn)品描述

偶聯(lián)anti-Flag-tag納米抗體的瓊脂糖珠子用于免疫沉淀Flag-tag (DYKDDDDK)融合蛋白。

產(chǎn)品優(yōu)勢

沒有普通抗體的輕鏈和重鏈；

即用型，節(jié)約時間；

高親和力，高載量;

應(yīng)用范圍

可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）、染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）/RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）、酶活性測定、質(zhì)譜分析等；

特異性

特異性結(jié)合Flag-tag。

產(chǎn)品特性

存儲緩沖液：PBS(含有20%乙醇)。

保存條件：可在4℃保存1年(確保*密封)，或在-80℃長期保存，避免反復(fù)凍融。

實驗步驟：

收集細(xì)胞
每個免疫沉淀反應(yīng)大約使用 10⁶-10⁷ 個表達(dá)Flag-tag融合蛋白的細(xì)胞，可根據(jù)Flag-tag融合蛋白表達(dá)量適當(dāng)調(diào)整細(xì)胞數(shù)。

吸出培養(yǎng)基，向培養(yǎng)皿中加入預(yù)冷的1×PBS，漂洗2次，利用細(xì)胞刮或胰酶消化收集貼壁細(xì)胞，細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管，500g離心3min并丟棄上清液。

植物組織裂解處理：

取適量植物組織樣本（葉片等）放置于冷凍液氮中，之后將冷凍后得植物組織樣本放于研缽進(jìn)行研磨，盡可能充分研磨破壞其細(xì)胞壁。加入500-1000ul RIPA 裂解液（已加蛋白酶抑制劑 PMSF 等）進(jìn)行裂解，為了提高裂解效率，加入 200ul 玻璃粉充分震蕩 30min，裂解完成后 12000 rpm，離心 30min，吸取上清 置新的離心管中，棄去沉淀。

細(xì)胞裂解

1.在裂解緩沖液中加入蛋白酶抑制劑，用500μl預(yù)冷的裂解緩沖液重懸細(xì)胞。

2.置于冰上30分鐘，可每10分鐘充分吹打一次。
3.4℃，20,000g離心15分鐘，將裂解產(chǎn)物（上清）轉(zhuǎn)移到一個新的預(yù)冷管中，丟棄沉淀。

注意：此時細(xì)胞裂解產(chǎn)物可長期保存于-80℃。

結(jié)合蛋白

4.將平衡好的Flag-Nanoab-Agarose加入到細(xì)胞裂解產(chǎn)物中（可在細(xì)胞裂解產(chǎn)物中直接加入20μl該產(chǎn)品），于4℃旋轉(zhuǎn)混合結(jié)合1小時。根據(jù)實驗需要可調(diào)整結(jié)合時間。如果需要，留存50μl的裂解產(chǎn)物進(jìn)行免疫印跡分析。
5.4℃，2,500g離心30秒，丟棄上清液。如果需要，留存50μl上清液進(jìn)行免疫印跡分析。

清洗珠子
6.用500μl預(yù)冷的裂解緩沖液中重懸6中的Flag-Nanoab-Agarose，4℃，2,500g條件下離心30秒，丟棄上清液并重復(fù)洗滌3次。盡量減少清洗時間。

洗脫蛋白
方法一：
7.加入20μl 2×SDS-sample buffer重懸Flag-Nanoab-Agarose。95℃，加熱10min充分變性，2,500g離心30秒收集上清，收集的產(chǎn)物可進(jìn)行SDS-PAGE及免疫印跡分析。
方法二：
8.替代步驟8的可選步驟：加入50μl 0.2M pH2.5的甘氨酸洗脫結(jié)合的蛋白，孵育時間30秒，期間不斷混勻，2,500g離心30秒收集上清，立即加入5μl 1.0M Tris（pH10.4）以中和酸性的甘氨酸。

注意：為了提高洗脫效率可以重復(fù)這一步。

如果洗脫的蛋白含量少，可嘗試用2×Flag-tag進(jìn)行親和純化。

可選方案
方案一：
如需進(jìn)行Flag融合酶的活性檢測，無需洗脫，可以直接檢測。
方案二：
如需進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗，主要用于含有Flag融合蛋白的蛋白質(zhì)/DNA相互作用的實驗。染色質(zhì)免疫沉淀一般包括細(xì)胞固定，染色質(zhì)斷裂，染色質(zhì)免疫沉淀，聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)，DNA的純化以及DNA的鑒定。其中前期細(xì)胞固定，染色質(zhì)斷裂不變；然后接著直接進(jìn)入說明書的第4步，加入細(xì)胞裂解產(chǎn)物后，DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合到Flag-Nanoab-Agarose上；
進(jìn)入第5和6步，分離得到復(fù)合物；進(jìn)入第8步，得到洗脫的復(fù)合物；后期交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)，DNA的純化及DNA的鑒定等同于普通的ChIP實驗。RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）實驗步驟同上。
方案三：
Flag-Nanoab-Agarose 不僅可以用于在體內(nèi)外檢測和驗證蛋白質(zhì)之間的相互作用，也可以結(jié)合質(zhì)譜分析篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白。其操作步驟同免疫沉淀法，得到洗脫的復(fù)合物后，然后進(jìn)行SDS–PAGE分析，用考馬斯亮藍(lán)或者銀染的方法染色后，切下未知蛋白的條帶，用質(zhì)譜技術(shù)鑒定未知蛋白。