貨號：B1013/4/5/6

存儲條件：-20℃儲存，組分 A需避光，避免反復凍融。

產(chǎn)品組分：

產(chǎn)品介紹

細胞凋亡的一個顯著特點是細胞染色體 DNA 的降解， 這種降解非常特異并有規(guī)律，所產(chǎn)生的不同長度的DNA片段為180 bp-200 bp的整數(shù)倍，表現(xiàn)為瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)特異的梯狀Ladder圖譜。本試劑盒采用 TUNEL 法，應(yīng)用末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）在凋亡細胞中斷裂DNA的3′-OH末端催化摻入 YF®/Cy-dUTP，YF®/Cy-dUTP 標記的 DNA 可以用熒光顯微鏡直接觀察或者用流式細胞儀定量。TUNEL 法可以選擇性的檢測凋亡細胞，而非壞死細胞或因輻照和藥物治療而造成的 DNA 鏈斷裂的細胞。標記的dUTP（如地gao辛-dUTP、生wu素-dUTP），可以直接進行原位檢測，是一種更快速、直接的檢測手段。

本試劑盒應(yīng)用范圍廣，可用于檢測冷凍或石蠟切片中的細胞凋亡情況，也可檢測培養(yǎng)的貼壁細胞或懸浮細胞的凋亡情況?？蛇x擇性的檢測凋亡細胞，而非壞死細胞或因輻照和藥物治療而造成的DNA鏈斷裂的細胞。本試劑盒檢測細胞凋亡，耗時短，只需一步染色反應(yīng)，洗滌后即可檢測。

使用方法

實驗材料（自備）

PBS 緩沖液（pH~7.4）

0.4%Triton X-100（PBS配制）

0.1%Triton X-100（PBS配制，其中含5 mg/mLBSA）

4%多聚甲醛（PBS 配制）

免疫組化筆 

脫蠟溶劑（石蠟切片樣本）

石蠟切片處理相關(guān)試劑

抗熒光淬滅封片劑

ddH2O

實驗設(shè)計

A. 陽性對照

DNaseI處理制備陽性對照載玻片。DNase I可以消化單鏈或雙鏈DNA暴露3'-OH末端，人為造成細胞凋亡。每次實驗做一次即可。（用來驗證本次實驗操作和試劑盒有無問題）

B. 陰性對照

使用不含TdT Enzyme的TUNEL Reaction Buffer，用ddH2O替代TdT Enzyme。（主要是排除細胞自身凋亡、操作過程等原因?qū)е碌姆翘禺愋匀旧?；以及調(diào)整拍攝曝光強度。）

C. 實驗處理組

實驗組按照說明書正常操作。

D. 實驗對照組

實驗組按照說明書正常操作。

實驗步驟

1、樣本準備：

（1）對于貼壁細胞或細胞涂片

a. PBS清洗1次。

注：如果擔心細胞涂片的細胞貼得不牢，可以干燥樣品使細胞貼得更牢。

b. 固定：加入適量4%多聚甲醛（PBS配制），4℃固定30min。PBS清洗2次。

c. 通透：加入適量0.4%TritonX-100（PBS配制），室溫通透20min。PBS 清洗2次。

d. 轉(zhuǎn)步驟2.TUNEL反應(yīng)。

（2）對于懸浮細胞或細胞懸液

a. 收集細胞（3-5×10⁶個細胞），1000rpm離心5min，PBS清洗2次。

b. 固定：加入適量4%多聚甲醛（PBS配制）充分重懸細胞，4℃固定30 min。2000 rpm離心5min，PBS清洗2次。

c. 通透：加入適量0.4%TritonX-100（PBS配制），室溫通透20min。2000 rpm離心5min，PBS清洗2次。

d. 轉(zhuǎn)步驟2.TUNEL反應(yīng)。 

（3）石蠟組織切片

a. 將石蠟切片置于切片架上，放置于60℃烘箱中烤片60min。

b. 脫蠟與水化：將切片樣本依次放入二甲苯I（10min）→ 二甲苯II（10min）→ 100％乙醇I（5min）→ 100％乙醇II（5min）→ 95%乙醇（5min）→ 90%乙醇（5min）→ 80%乙醇（5min）→ 70%乙醇（5min）→ ddH2O沖洗5min，沖洗2次。

注：二甲苯有毒，易揮發(fā)，請在通風櫥中進行此操作。

c. 用濾紙吸干切片樣本周圍液體，用免疫組化筆圈好樣本輪廓，以便下游通透與標記。

注：若后續(xù)實驗操作中發(fā)現(xiàn)免疫組化筆畫的輪廓圈被破壞，需及時補畫。

d. 通透：按1:50的比例，將2mg/mL的Proteinase K溶液用PBS稀釋至終濃度40µg/mL，在每個樣本上滴加100µL，使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域，37℃孵育30min。

注：Proteinase K 可通透細胞膜和核膜，從而使后續(xù)步驟的染色試劑充分進入細胞核進行反應(yīng)，提高標記效率。孵育時間過長會增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風險，過短則可能造成透性處理不充分，影響標記效率。為得到更好的結(jié)果，Proteinase K的濃度、孵育時間、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進行優(yōu)化。

e. 將切片樣本浸入1×PBS漂洗三次，每次5min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣本放在濕盒中保持濕潤。

注：這一步必須把Proteinase K洗滌干凈，否則會嚴重干擾后續(xù)的標記反應(yīng)。

f. 轉(zhuǎn)步驟2. TUNEL反應(yīng)。

（4）冰凍組織切片

a. 固定：取出冰凍切片，并回溫至室溫。將切片樣本浸入4%多聚甲醛（PBS配制）中，室溫固定30min。將切片樣本浸入1×PBS漂洗三次，每次10min。

注：若是擔心甲醛清洗不干凈，影響最終染色效果?？稍诩兹┕潭ㄍ瓿珊蠹尤脒m量2mg/mL甘an酸清洗10min，中和殘留的固定液，再進行PBS清洗。

b. 用濾紙吸干切片樣本周圍液體，用免疫組化筆圈好樣本輪廓，以便下游通透與標記。

注：若后續(xù)實驗操作中發(fā)現(xiàn)免疫組化筆畫的輪廓圈被破壞，需及時補畫。

c. 通透：按1:50的比例，將2mg/mL的Proteinase K溶液用PBS稀釋至終濃度40µg/mL，在每個樣本上滴加100µL，使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域，37℃孵育20min。

注：Proteinase K 可通透細胞膜和核膜，從而使后續(xù)步驟的染色試劑充分進入細胞核進行反應(yīng)，提高標記效率。孵育時間過長會增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風險，過短則可能造成透性處理不充分，影響標記效率。為得到更好的結(jié)果，Proteinase K的濃度、孵育時間、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進行優(yōu)化。如優(yōu)化Proteinase K的濃度與孵育時間仍無法改善染色效果，可選擇將樣本浸入1% Triton X-100（PBS配制）中，室溫促滲3-5min；之后將切片樣本浸入1×PBS漂洗三次，每次5min。

d. 將切片樣本浸入1×PBS漂洗三次，每次5min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣本放在濕盒中保持濕潤。

注：這一步必須把ProteinaseK洗滌干凈，否則會嚴重干擾后續(xù)的標記反應(yīng)。

e. 轉(zhuǎn)步驟2.TUNEL反應(yīng)。

（5）陽性處理（僅陽性對照進行此步驟，其他樣品直接進行TUNEL反應(yīng)步驟）

a. 按1:10 的比例用ddH2O將10×DNase I Buffer稀釋成1×DNase I Buffer 備用。

b. 滴加100µL 1×DNase I Buffer到已處理的樣本上，覆蓋全部樣本區(qū)域，室溫平衡5min。

c. 用1×DNase I Buffer 以1:100 稀釋 DNase I (2 U/μL)至終濃度20 U/mL的工作液。

d. 棄去Buffer，加入100 μL濃度為20U/mL的DNaseI工作液，室溫孵育15min。

e. 棄去DNase I工作液，PBS清洗2次。

f. 轉(zhuǎn)步驟2. TUNEL反應(yīng)。

2、TUNEL反應(yīng)

（1）配制TUNEL反應(yīng)液（即用即配）

（2）對于貼壁細胞、細胞涂片或組織切片

 a. 每個樣本加入50 μL TUNEL反應(yīng)液，使反應(yīng)液均勻覆蓋樣本。37℃避光孵育適宜的時間（細胞推薦染色時間15-30minh，組織染色時間推薦1h）。 

注：50 μL TUNEL反應(yīng)液適合涂片、切片或96孔板（其他不同孔板可以適當調(diào)整TUNEL反應(yīng)液體積，覆蓋細胞即可）。如果待檢測的樣品為涂片、切片或在24孔板、12孔板或6孔板中，可以使用防蒸發(fā)膜，或自行嘗試使用自封袋或者其它適當材料自行裁剪成比孔略小的圓形塑料片，滴加TUNEL反應(yīng)液后覆蓋在樣品上，可以防止TUNEL反應(yīng)液蒸發(fā)，并且使TUNEL反應(yīng)液均勻覆蓋樣本。

b. 棄去TUNEL反應(yīng)液，PBS清洗2次后，再用0.1% Triton X-100 （PBS配制，其中含5mg/mLBSA）清洗3次，每次5min，這樣游離的未反應(yīng)的標記物可以清除較干凈。

c.（可選）每個樣本加入適量濃度為5 μg/mL的DAPI染液，室溫避光孵育5min。染色完成后，棄去DAPI染液，PBS清洗2次，每次5min。

d.（可選）切片封片：每個樣本滴加20 μL抗熒光淬滅封片劑（抗熒光淬滅封片劑可能會不適用于某些染料，實驗前建議進行預(yù)實驗測試匹配性），蓋上蓋玻片，用鑷子的鈍端輕輕敲擊蓋玻片，去除氣泡以使封片wan全。

e. 用濾紙吸去多余的液體，向樣本區(qū)域加100 μL PBS保持樣本濕潤，立即在熒光顯微鏡下觀察。

（3）對于懸浮細胞或細胞懸液

a. 每個樣本管加入50 μLTUNEL反應(yīng)液輕輕重懸細胞，37℃避光孵育15-30min。每隔10 min用微量移液器輕輕重懸細胞。

b. 2000 rpm離心5min，棄去TUNEL反應(yīng)液，用0.1% Triton X-100（PBS配制，其中含5mg/mL BSA）清洗2次，每次5min，這樣游離的未反應(yīng)的標記物可以清除較干凈。

c. 每個樣本管加入100 μL濃度為5 μg/mL的DAPI染液，室溫避光孵育5min。

d. 加入400 μL PBS重懸細胞，立即用流式細胞儀檢測或進行涂片后在熒光顯微鏡下觀察。

注意事項

1. 使用前請將產(chǎn)品瞬時離心至管底，再進行后續(xù)實驗。

2. 染色背景較重或非特異性著色明顯時可適當減少染色時間。

3. 實驗時建議增加陰性對照和陽性對照組。

4. 組分A使用時請佩戴口罩、手套，如接觸皮膚，請立即用大量水沖洗。

5. 熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

6. 本產(chǎn)品僅限于科研，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。 

7. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。