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產(chǎn)品中心分子生物學(xué)試劑qPCR相關(guān)R02122x示蹤型定量試劑盒
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
product
產(chǎn)品分類(lèi)| 品牌 | LABLEAD | 貨號(hào) | R0212 |
|---|---|---|---|
| 供貨周期 | 一周 |
2x示蹤型定量試劑盒
貨號(hào)：R0212
儲(chǔ)存條件：長(zhǎng)期保存請(qǐng)于 -20℃避光保存，解凍后可在 4℃避光條件下穩(wěn)定存放一個(gè)月，盡量避免反復(fù)凍融。
產(chǎn)品組分：
組分 | 貨號(hào) | 500T | 1000T | 2500T |
2x Visual SYBR qPCR mixture Universal | R0212-A | 4*1.25ml | 8*1.25ml | 20*1.25ml |
10× Dilution Buffer | R0212-B | 1ml | 2*1ml | 5*1ml |
產(chǎn)品描述
2x Visual Realab Green PCR Fast mixture通用型（示蹤型定量試劑盒）是SYBR Green l嵌合染料法專(zhuān)用 qPCR 試劑，為2x預(yù)混液，包含除引物和 DNA 樣品以外的所有 qPCR 組分，可減少操作步驟，縮短加樣時(shí)間，降低污染幾率。其核心組分是經(jīng)抗體修飾的熱啟動(dòng) Tag DNA 聚合酶，配合精心優(yōu)化的 Buffer 體系以及 PCR 反應(yīng)促進(jìn)因子，特異性強(qiáng)、擴(kuò)增效率高，可有效抑制非特異性擴(kuò)增，對(duì)寬廣濃度范圍的模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量，獲得穩(wěn)定可靠的 qPCR結(jié)果。本品已含有通用校正染料，與絕大多數(shù) qPCR 設(shè)備兼容，不需要額外添加染料來(lái)校正儀器。
本品可利用不同染料混合后產(chǎn)生的變色效應(yīng)，追蹤移液過(guò)程，從而顯著減少移液錯(cuò)誤。2x Visual Realab Green PCR Fast mixture通用型中包含藍(lán)色染料，10x Dilution Buffer 中包含黃色染料。當(dāng) 2x Visual Realab Green PCR Fast mixture通用型(藍(lán)色)中加入了用 Dilution Buffer稀釋的模板(黃色)后會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色→綠色的變色效應(yīng)，從而可以根據(jù)液體顏色準(zhǔn)確判斷是否已加入模板。
使用方法：
1. 模板稀釋
使用過(guò)程中，如需要進(jìn)行移液追蹤，則根據(jù)下表選擇合適的方式提前添加 Dilution Buffer 至模板中，然后進(jìn)行 qPCR 檢測(cè);如不需要進(jìn)行移液追蹤，則不使用 Dilution Buffer 即可。
DNA 模板狀態(tài) | 10× Dilution Buffer 使用方式 | 模版中Dilution Buffer 濃度 |
固體 | 使用 ddH,0 將 10x Dilution Buffer 稀釋至 1x，使用 1xDilution Buffer溶解 DNA | 1x |
液體 | 如有必要，先使用 ddH20 將模板稀釋至目標(biāo)濃度，然后在每 9μl模板中加入 1ul 10x Dilution Buffer | 1x |
建議的 qPCR 反應(yīng)體系
試劑 | 使用量 | 終濃度 |
2x Visual SYBR qPCR mixture Universal | 10ul | 1 x |
正向引物（10uM）a | 0.4ul | |
反向引物（10uM）a | 0.4ul | |
DNA模版b | X ul | |
Nuclease-Free Water | To 20ul |
a. 通常推薦的引物終濃度為 0.2 μM，可在 0.1~1 μM 范圍內(nèi)調(diào)整；
b. 如使用 Dilution Buffer 進(jìn)行加樣追蹤，模板體積請(qǐng)勿超出2~5μl/20 μl reaction。
如果模板用量低于 2 μl/20 μl reaction，會(huì)造成顯色偏淡，影響追蹤效果；如果模板用量高于 5 μl/20 μl reaction，Dilution Buffer 中的成分可能會(huì)干擾 qPCR 反應(yīng)。不同種類(lèi) DNA 模板中含有的靶基因拷貝數(shù)目不同，必要時(shí)可進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)源_定最佳的 DNA 模板添加量。
注：當(dāng)模板類(lèi)型為未稀釋 cDNA 原液時(shí)，不論其是否包含 1× Dilution Buffer，使用體積均不應(yīng)超過(guò) qPCR 反應(yīng)總體積的 1/10，即 2 μl/20 μl reaction。
3. qPCR 反應(yīng)程序（可根據(jù)機(jī)型適當(dāng)調(diào)整）
兩步法
步驟 | 溫度 | 時(shí)間 | 循環(huán) |
預(yù)變性 | 95℃ | 30s | |
變性 | 95℃ | 10s | 40cycles |
退火 & 延伸a | 60℃ | 30s | |
溶解曲線 | 使用儀器默認(rèn)采集程序 | ||
三步法
步驟 | 溫度 | 時(shí)間 | 循環(huán) |
預(yù)變性 | 95℃ | 30s | |
變性 | 95℃ | 10s | 40 cycles |
退火a | 55~65℃ | 10s | |
延伸a | 72℃ | 30s | |
溶解曲線 | 使用儀器默認(rèn)采集程序 | ||
a.根據(jù)引物的 Tm 值進(jìn)行退火&延伸(退火)溫度的設(shè)定;若擴(kuò)增片段在 200bp 以?xún)?nèi)，退火 &延伸(延伸)時(shí)間可以設(shè)置為 15 s;此外，退火&延伸(延伸)時(shí)間的設(shè)置還需根據(jù)您使用的 qPCR 儀所需要的最短數(shù)據(jù)采集時(shí)間自行調(diào)整。
4.實(shí)驗(yàn)優(yōu)化
① 引物濃度調(diào)整
當(dāng)引物終濃度在 0.1~1.0 μM 范圍之間變化時(shí)，引物濃度越低,擴(kuò)增特異性越高，但擴(kuò)增效率會(huì)有所下降。
② 擴(kuò)增程序優(yōu)化
需提高擴(kuò)增特異性，可使用兩步法程序或提高退火溫度;需提高擴(kuò)增效率，可使用三步法程序或延長(zhǎng)延伸時(shí)間。
5.引物設(shè)計(jì)原則
① 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度建議控制在 80~200 bp;
② 引物長(zhǎng)度為 18~25 bp;
③ 兩條 Tm 值相差不超過(guò) 1℃，Tm 值控制在 58~62℃;
④ 引物的 GC 含量控制在 40%~60%;
⑤ 引物 A、G、C、T 整體分布盡量要均勻，避開(kāi) T/C 或者 A/G 的連續(xù)結(jié)構(gòu)(特別是 3' 端)，3' 端最后一個(gè)堿基最好為 G 或者 C;
⑥ 避開(kāi)引物內(nèi)部或者兩條引物之間的互補(bǔ)序列;
⑦ 使用 NCBI BLAST功能檢索確認(rèn)引物的特異性。
010-60608020
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