在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，
反轉(zhuǎn)錄試劑是開(kāi)展RT-PCR、基因表達(dá)分析等實(shí)驗(yàn)的核心耗材，其活性與穩(wěn)定性直接決定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。不少新手因分裝操作不當(dāng)、保存條件不符，導(dǎo)致試劑失效、實(shí)驗(yàn)重復(fù)失敗，既浪費(fèi)資源又延誤研究進(jìn)度。作為實(shí)驗(yàn)室“老手”，結(jié)合多年實(shí)操經(jīng)驗(yàn)，我總結(jié)了反轉(zhuǎn)錄試劑分裝與保存的關(guān)鍵要點(diǎn)，幫你避開(kāi)常見(jiàn)“坑”。
一、分裝前：做好準(zhǔn)備，避免“開(kāi)局錯(cuò)”
反轉(zhuǎn)錄試劑成分復(fù)雜，含逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、緩沖液等，對(duì)溫度、污染極為敏感，分裝前的準(zhǔn)備工作至關(guān)重要。首先要提前規(guī)劃用量，根據(jù)日常實(shí)驗(yàn)頻率確定分裝體積——若每周實(shí)驗(yàn)3-5次，建議將1mL規(guī)格試劑分裝入10-20個(gè)200μL離心管，避免單次分裝過(guò)多反復(fù)凍融；若實(shí)驗(yàn)頻次低，可采用50μL小體積分裝，減少試劑暴露次數(shù)。
其次需提前準(zhǔn)備專(zhuān)用耗材與設(shè)備：離心管選擇無(wú)酶、無(wú)RNA酶的進(jìn)口品牌（如Axygen、Eppendorf），避免國(guó)產(chǎn)劣質(zhì)管殘留的酶抑制劑影響活性；移液器需校準(zhǔn)，槍頭同樣選用無(wú)酶款，且提前在超凈臺(tái)內(nèi)紫外線消毒30分鐘。同時(shí)，將分裝用離心管提前標(biāo)記試劑名稱(chēng)、濃度、分裝日期，避免后續(xù)混淆。
二、分裝中：嚴(yán)格控溫，操作“穩(wěn)準(zhǔn)快”
從-20℃冰箱取出后，需立即放入冰盒（4℃環(huán)境），嚴(yán)禁室溫放置——逆轉(zhuǎn)錄酶在室溫下10分鐘就可能失活30%以上。分裝時(shí)全程在超凈臺(tái)內(nèi)操作，保持手部穩(wěn)定，避免移液器槍頭觸碰離心管內(nèi)壁，防止交叉污染。
加樣時(shí)遵循“慢吸慢打”原則：吸取試劑時(shí)移液器按鈕按至第一檔，待液體緩慢進(jìn)入槍頭后稍作停留，避免產(chǎn)生氣泡；加樣時(shí)槍頭貼近離心管底部，緩慢推出液體，減少試劑掛壁。每分裝完一支離心管，立即蓋緊蓋子并放回冰盒，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露在室溫下。全部分裝完成后，將離心管快速放入-80℃冰箱冷凍30分鐘（若長(zhǎng)期保存），或直接放入-20℃冰箱短期使用（建議1個(gè)月內(nèi)用完）。
三、保存與使用：細(xì)節(jié)把控，延長(zhǎng)“活性期”
它的保存溫度需嚴(yán)格區(qū)分成分：逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑等酶類(lèi)試劑，長(zhǎng)期保存需置于-80℃冰箱，短期（1周內(nèi)）可放-20℃；dNTPs、緩沖液等非酶類(lèi)試劑，-20℃冰箱即可長(zhǎng)期保存。嚴(yán)禁將試劑反復(fù)凍融——每次使用時(shí)從冰箱取出后，立即放入冰盒，待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，剩余試劑需在30分鐘內(nèi)放回對(duì)應(yīng)溫度冰箱，每支試劑凍融次數(shù)不超過(guò)3次，否則會(huì)導(dǎo)致酶活性急劇下降。
此外，保存過(guò)程中需注意避光：部分反轉(zhuǎn)錄試劑中的dNTPs對(duì)光照敏感，長(zhǎng)期暴露會(huì)發(fā)生降解，建議將試劑存放在不透光的試劑盒中，或用鋁箔紙包裹離心管。使用前需將試劑在冰盒中緩慢解凍，待全溶解后輕輕顛倒離心管3-5次混勻，避免劇烈振蕩（防止酶變性），混勻后短暫離心（5000rpm，10秒），使試劑集中在離心管底部，再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
掌握正確的分裝與保存方法，不僅能延長(zhǎng)它的使用壽命，更能保障實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性與重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)室操作無(wú)小事，每一個(gè)細(xì)節(jié)的把控，都是科研順利推進(jìn)的關(guān)鍵。
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更新時(shí)間：2025-10-16
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